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新型胞嘧啶堿基編輯器拓展C/G-T/A單堿基編輯適用範圍研究獲進展

文章來源:脑科学与智能技术卓越创新中心/神经科學研究所   發布時間:2019-08-12  【字號:     】  

  89日,《自然-通訊》雜志在線發表了題爲《多種胞苷脫氨酶爲基礎擴展的C-T单碱基编辑工具》的研究論文。该研究由中國科學院脑科学与智能技术卓越创新中心/神经科學研究所、上海脑科学与类脑研究中心、神经科学國家重點實驗室仇子龙研究组与复旦大学中山医院教授王小林实验室合作完成。该研究以新的胞苷脱氨酶为基础构建出多种新型的CBE工具。與傳統CBEs相比,新型CBEs的單堿基編輯窗口更加多樣化,脫靶風險也顯著降低,這爲C/G-T/A單堿基編輯技術的更廣泛應用提供了有力工具。

  CRISPR/Cas9技術的誕生讓高效基因編輯成爲可能,但同源重組介導的精准基因編輯效率有限,限制了該技術的廣泛應用。2016年以來,研究者發現將堿基脫氨酶(如胞苷脫氨酶APOBEC1及腺苷脫氨酶TadA變體)與CRISPR/Cas系統整合開發出的單堿基編輯系統,可在不切斷DNA雙鏈的情況下精准引入C/G-T/AA/T-G/C點突變,從而實現高效精准的基因編輯。理論上講,單堿基編輯系統可用于數百種遺傳病的治療,因此具有極大的臨床應用潛力。

  現有的胞嘧啶堿基編輯器CBE系統中,其核心的胞苷脫氨酶主要取自經典的AID/APOBEC蛋白家族,因此其編輯窗口和特異性有明顯的相似性。雖然研究者嘗試通過不同的策略,如不同的CRISPR系統、各類Cas9變體及SunTag系統以拓展編輯窗口,現有CBE系統的編輯窗口依然有限,這極大地限制了該系統的適用範圍。

  爲增加CBE系統編輯窗口的多樣性,拓展其單堿基編輯的適用範圍,仇子龍團隊對新近發現的十數種七鰓鳗來源的胞苷脫氨酶進行系統性篩選,在此基礎上構建的新型CBE系統的編輯窗口更加多樣化,且編輯範圍明顯增加(圖)。研究團隊還發現,胞苷脫氨酶與nCas9的融合策略不同,其編輯窗口也會發生改變:通常情況下,與nCas9氨基末端融合相比,nCas9羧基末端融合的胞苷脫氨酶有著更窄更精准的編輯窗口。除此之外,研究團隊還對不同CBE系統的特異性進行了系統比較,發現新構建的N-1-BE, N-7-BE, C-8-BEN-12-BE系統的脫靶風險明顯降低,呈現出更高的特異性。新型CBE系統在編輯窗口和特異性上的改善爲單堿基編輯技術的應用提供了更多選擇,新的胞苷脫氨酶也爲未來單堿基編輯工具的開發和改善提供了基礎。

  仇子龙组的助理研究员程田林为该研究論文的第一作者和共同通讯作者,王小林实验室博士后李硕和仇子龙组助理研究员袁博在课题研究中发挥重要作用。该课题在仇子龙的指导下完成,并得到脑智卓越中心流式分选平台的大力协助。该工作得到国家自然科学基金、上海市科学技术委员会项目和上海市慈善基金会荣昶公益基金的资助。

 

    图注:CBE系統的分類,CBE系統的活性窗口定義爲sgRNA中編輯效率>40%C位點。a 前置型CBEFSCBEs),其活性窗口主要位于sgRNA靶位點的前端(PAM位點看作最末端)。(b)後置型CBEBSCBEs),活性窗口主要位于sgRNA靶位點的後端。(c)廣譜型CBEBRCBEs),活性窗口橫跨sgRNA靶位點的前後端。




(責任編輯:葉瑞優)

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